冻存试剂、样品可以室温或37℃水浴解冻吗?

　　冻存试剂或样品的解冻，如果时间比较充裕，建议在冰浴或冰水浴上缓慢解冻。如果时间比较着急，大多数冻存的试剂或样品是可 以在室温或37℃水浴解冻(例如抗生素一些产品不建议客户37度水浴)，但都必须特别小心，必须边观察、边轻轻晃动、边融解。待 部分溶解后即需从水浴中取出，确保溶解过程中试剂或样品还是接近0℃的。如果该试剂或样品在0℃不会结冻，解冻后可以置于冰浴或冰水浴。

　　为了使生物样品在一定的时间内保持稳定，人们按不同需求将样品保存在4℃，-20℃，-80℃ 或温度更低的冰箱中，或者保存在液氮中。本生本文谈谈生物样品低温保存尤其是冻存时需要注意的一些问题。

　　1. 保存的组织样品要尽快冻存

　　样品贮存的温度对有效保存时间的影响很大。选择合适的贮存方式和贮存温度很重要。但为了实验结果的客观性，研究者也要充分注意样品在贮存或固定的处置时间和方式。样品从开始收获到固定或低温保存这段时间，仍有一些生化过程在较快地进行。这些生化反应的速度直到样品被固定或者低温保存时才显著降低。这一段时间越短越好。对于手术切除的组织，热缺血(warm ischemia)时间越短越好;对于实验动物，处死取样时挣扎时间越短越好。这有助于防止因环境改变而导致基因表达水平或蛋白磷酸化状态产生较大变化。一些较复杂的手术可能进行几个小时甚至整天，那么被切割但未被切离的那部分组织可能经历较长的热缺血时间，从而导致较大的生化变化。为了尽可能减少热缺血的影响，一些手术室门放置了液氮容器，组织一旦切下就被投入液氮进行急冻(snap freezing);对于耗时较长的手术，有人先在短时间内切下有代表性的小部分组织用于研究，然后再进行耗时较长的切除;有人在条件有，采用了将热缺血状态转为冷缺血(cold ischemia )状态的办法减少样品的变化。他们先把切下的组织置于冰上或4℃ 冰箱中放置短时间，方便时再将样品置于-80 ℃冰箱或液氮保存。总之，从样品开始采集到被冻存或固定，这段时间越短越好，一般不要超过20分钟。当然不同组织生化过程的变化快慢有异。当组织来不及冻存时，可将其剪成小块，放于组织保存液如RNAsafety?中。

　　2. 样品冻存的优缺点

　　相比于FFPE样品，冻存组织的DNA 和RNA的得率高，片段长，质量好。可用于基因芯片和新一代测序等高通量基因组学检测。不同于FFPE样品，冻存组织内的蛋白质(如酶类)仍然保持生物活性，可用于某些检测。但对冻存样品，需要注意一些问题。冻存组织的形态学检测效果有时不如FFPE样品精细、(例如用于免疫组织化学检测时);某些病理组织内的一些感染性因子冻存后仍然保持活性，处理这些样品时需要格外注意;组织样品中的RNA在-80℃ 冻存时仍然不是稳定的，有人观察到5年后RNA出现降解;核酸、蛋白质等大分子经过反复冻融，有可能断裂成较小片段;冻存耗能较多，需要较多门的空间，成本高昂;当冻存设备发生故障时，大批珍贵的样品有可能被破坏，从而导致巨大的损失;当用液氮冻存样品时，还要防范冻伤、液氮容器爆炸及因空间密闭等导致窒息等风险。

　　3. 冻存温度的选择

　　已述及，根据一般的物理化学规律，温度越低，样品的稳定时间越长。在超低温冰箱面世之，-20℃ 冰箱是常用的低温贮存工具。实践证明，-20℃ 时组织内的大分子仍然可以被降解。而且，0至-60℃ 是水的结晶温度。结晶容易对细胞和组织的微观结构造成伤害，一般不在这一温度范围来保存组织和细胞。一些经过提纯的大分子可以在这一温度范围内短期保存。目，大多数生物和医学研究机构用-80℃ 冰箱或液氮冻存生物样品。-80℃低于危害性较大的结晶温度范围，也是常用设备超低温冰箱能达到的温度。但在-80℃温度下，不同的生物样品的保存时间是不一致的。组织中的DNA可以在-80℃下可以保持数年或更长时间。组织中的RNA在-80℃下的稳定性随不同组织或细胞而异，但一般不超过5年。一些组织内的RNA在-80℃下不到一年就发生了降解。为了保存组织内的RNA，可以将组织切成尺寸小于0.5cm 的小块，没入5-10倍体积的RNAsafety?等组织培养液中，置于冻存管内，冰冻保存。RNAsafety?溶液能够较好地维持RNA的完整性。甚至那些已知RNA酶含量较高的组织中的RNA也可以在RNAsafety?保存液中得以冻存。

　　随着制冷技术的，深低温冰箱已经出现在某些实验室。这类冰箱制冷温度可达到-150℃。它不需要像液氮罐那样需要频繁监控液氮消耗情况。箱内温度也比较均匀恒定，但深低温冰箱降温速度低于液氮，一旦开启取放样品时容易造成较大范围的温度波动，温度恢复时间也相对较长。另外深低温冰箱能耗很大，且必须保障供电。

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