如何科学正确地使用冻存管

　　冻存管的使用是一门学问，并不是打开液氮罐、放入冻存管、关上液氮罐这样简单的三部曲可以完成的。科学正确地使用冻存管，可以避免样本的损失，并保护试验人员的安全。

　　冻存管有IATA航空运输协会标准测试证书，常规储存细胞培养物，组织样品，微生物样品(如病毒，细菌，酵母，真菌，孢子等)，人源或动物源其它生物样品(如血液，血清，精液，抗体，RNA, DNA和蛋白样本)，不适合存储再生医学样本。

　　冷冻步骤:

　　用预热的PBS溶液洗涤细胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆盖细胞(薄薄的液层足够，胰蛋白酶和EDTA的浓度需要根据细胞系确定)。

　　37℃孵育细胞3-5分钟。

　　细胞从底部脱离之后，终止孵育，加入含有血清的培养基，用移液器轻轻地悬浮细胞。

　　离心细胞悬液(500 x g, 5分钟)，用含有血清的培养基重新悬浮。

　　细胞计数。

　　离心细胞悬液(500 x g, 5分钟)，去除上清液，用适量体积的含有血清的培养基重新悬浮细胞。

　　以1:1体积比混合细胞和冻存液(60%培养基，20%胎牛血清，20% DMSO)，然后转移到冻存管中。冻存的细胞密度为 1-5×106 个/毫升。

　　含有细胞的冻存管建议以−1 K / min 的速率降温，可以将冻存管置于−70℃含有异丙醇的容器中。如果冻存管存储其他样品，可以直接放置在−20℃，−70℃或者液氮的气相。为了确保样品冷冻均匀，4 mL和5 mL的冻存管需要先置于在−20℃冰箱过夜，然后再转移到−70℃或者液氮的气相。

　　然后转移冻存管到液氮罐。为了避免污染(如支原体)和安全考虑，请将冻存管置于液氮的气相，切勿置于液相。

　　解冻步骤:

　　从液氮罐取出冻存的细胞后立即置于37℃水浴摇晃Cryo.sTM冻存管1-2分钟。解冻过程需要越快越好。

　　转移解冻的细胞于15 mL离心管，立即用大量的含有血清的细胞培养基混匀。

　　500 x g离心细胞5 分钟，去除上清液，用适量的含有血清的细胞培养基重新悬浮细胞，然后转移到细胞培养瓶。

　　按照建议的细胞浓度接种。

　　接下来的12小时细胞进入静默期。

　　间隔24小时和48小时更换培养基

　　如果细胞感染了新冠病毒，也可以参考以上步骤进行冷冻存储和解冻的操作。

　　冻存管安全操作建议：

　　冻存管用来存储样品，只能置于液氮气相或冰箱。禁止冻存管浸没于液氮液相，否则液氮可能渗入冻存管。因此，解冻时，蒸发的液氮产生高压力，*终导致冻存管炸裂，并且还将导致感染物质释放。

　　因此，操作冻存管时需要佩戴合适的个人安全防护措施，如穿戴安全防护服、佩戴护目镜、在安全橱操作。

　　进行冷冻保存时，冻存管需要缓慢地降温至冷冻温度。如果不是缓慢地降温到冷冻温度，将导致冰塞形成(如在冻存管顶部)，冰塞将阻碍液体形成凝固，将导致高压力危险和后续的爆管风险。

原创作者：本生（天津）健康科技有限公司