BUNSEN本生分享：pcr实验原理及详细操作步骤

　　实验方法原理

　　基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

　　PCR由变性－－退火－－延伸三个基本反应步骤构成：

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备;

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

　　③引物的延伸：DNA模板－－引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

　　重复循环变性－－退火－－延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　　实验材料 模板DNA

　　试剂、试剂盒 dNTPTaq DNA聚合酶蒸馏水PCR缓冲液引物氯化镁

　　仪器、耗材 PCR仪 移液枪 PCR板 薄壁管 离心管 离心管盒

　　实验步骤

　　一、标准的PCR反应体系

　　10×扩增缓冲液 　 10 ul

　　4种dNTP混合物 　 各200 umol/L

　　引物 　　　　 　 各10～100 pmol

　　模板DNA 　　　 　0.1～2 ug

　　Taq DNA聚合酶 　 2.5 u

　　Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L

　　加双或三蒸水至 　 100 ul

　　二、PCR引物设计

　　PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准)，5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

　　1. 引物设计的基本原则

　　(1) 引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。

　　(2) 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC zui好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　(3) 引物内部不应出现互补序列。

　　(4)两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

　　(5) 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有*互补序列，否则易导致非特异性扩增。

　　(6)引物3‘端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，jia选择是G和C。

　　(7) 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高xin标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

　　2. 引物设计软件

　　Primer Premier5.0 (自动搜索)*、Oligo6 (引物评价)、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 (在线服务)。

　　三、模板的制备

　　(1)PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

　　(2)模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

　　(3)标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、lv仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

　　四、PCR反应条件的控制

　　1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。

　　2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。

　　3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。

　　4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。

　　5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。

　　6. 反应温度

　　(1)变性温度和时间95℃，30 s。

　　(2)退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

　　(3)延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内)。

　　(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)

　　7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

　　五、PCR的循环参数

　　1. 预变性(Initial denaturation)

　　模板DNA*变性与PCR酶的*激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

　　2. 循环中的变性步骤

　　循环中一般95℃，30足以使各种靶DNA序列*变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不*，易造成扩增失败。

　　3. 引物退火(Primer annealing)

　　退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。

　　4. 引物延伸

　　引物延伸一般在72℃进行(Taq酶适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略

　　延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

　　5. 循环数

　　大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

　　6. 后延伸

　　在后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸*，并使单链产物退火成双链。

　　六、PCR步骤

　　1. DNA变性

　　(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。

　　2. 退火

　　(25℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

　　3. 延伸

　　(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性*)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

　　七、PCR检测

　　PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭，EB)染色凝胶电泳是常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

　　注意事项

　　1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。

　　2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。

　　3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。

　　4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失;试剂分装也有助于减少反复冻融次数(例如dNTPs对反复冻融敏感)。

　　5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以充分混匀。

　　6. 使用阴性对照检查污染的发生。

　　7. 使用阳性对照(能良好扩增的样本)。

　　8. 电泳时使用DNA分子量标准品(指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败)。

　　9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二结构的模板时适量使用添加剂(glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度;glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用;DMSO 减少二结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性)。

　　10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶(避免反复冻融)，每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。

　　11. PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些zui好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

　　收起

　　其他

　　一、 PCR反应的关键环节

　　1. 模板核酸的制备。

　　2. 引物的质量与特异性。

　　3. 酶的质量。

　　4. PCR循环条件。

　　二、 PCR常见问题及对策

　　1. 假阴性，不出现扩增条带

　　(1)模板原因

　　① 模板中含有杂蛋白质。

　　② 模板中含有Taq酶抑制剂。

　　③ 模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白。

　　④ 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

　　⑤ 模板核酸变性不*。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

　　(2)酶失活

　　① 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。

　　② 忘加Taq酶或溴乙锭。

　　(3)引物

　　① 引物质量。

　　② 引物的浓度。

　　③ 两条引物的浓度是否对称。

　　解策：

　　① 选定一个好的引物合成单位。

　　② 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

　　③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

　　④ 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　(4)Mg2+浓度

　　① 浓度过高降低PCR扩增的特异性。

　　② 浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　(5)反应体积的改变

　　① 通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定;

　　② 在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

　　(6)物理原因

　　① 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，有可能出现假阴性。

　　② 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

　　③ 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。

　　(7)靶序列变异

　　① 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合。

　　② 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。

　　2. 假阳性，出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　(1)引物设计不合适

　　① 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。

　　② 靶序列太短或引物太短。

　　(2)靶序列或扩增产物的交叉污染

　　① 整个基因组或大片段的交叉污染。

　　解决方案：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

　　② 空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。

　　解决方案：可用巢式PCR方法来减轻或消除。

　　3. 出现非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

　　(1) 引物与靶序列不*互补或引物聚合形成二聚体。

　　(2) Mg2+离子浓度过高。

　　(3) 退火温度过低。

　　(4) PCR循环次数 过多有关。

　　(5) 酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

　　其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

　　4. 出现片状拖带或涂抹带

　　(1)原因

　　① 酶量过多。

　　② 酶的质量差。

　　③ dNTP浓度过高。

　　④ Mg2+浓度过高。

　　⑤ 退火温度过低。

　　⑥ 循环次数过多引起。

　　(2)对策。

　　① 减少酶量。

　　② 调换另一来源的酶。

　　③ 减少dNTP的浓度。

　　④ 适当降低Mg2+浓度。

　　⑤ 增加模板量。

　　⑥ 减少循环次数。

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