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BUNSEN本生分享:pcr实验原理及详细操作步骤#2023已更新
阅读次数:15288 发布时间:2023/11/20 9:31:00
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  BUNSEN本生分享:pcr实验原理及详细操作步骤

  实验方法原理

  基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

  PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

  ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;

  ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

  ③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

  重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

  实验材料 模板DNA

  试剂、试剂盒 dNTPTaq DNA聚合酶蒸馏水PCR缓冲液引物氯化镁

  仪器、耗材 PCR仪 移液枪 PCR板 薄壁管 离心管 离心管盒

  实验步骤

  一、标准的PCR反应体系

  10×扩增缓冲液   10 ul

  4种dNTP混合物   各200 umol/L

  引物        各10~100 pmol

  模板DNA      0.1~2 ug

  Taq DNA聚合酶   2.5 u

  Mg2+       1.5 mmol/L

  加双或三蒸水至   100 ul

  二、PCR引物设计

  PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

  1. 引物设计的基本原则

  (1) 引物长度:15-30 bp,常用为20 bp左右。

  (2) 引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC zui好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

  (3) 引物内部不应出现互补序列。

  (4)两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。

  (5) 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有*互补序列,否则易导致非特异性扩增。

  (6)引物3‘端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,jia选择是G和C。

  (7) 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高xin标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。

  2. 引物设计软件

  Primer Premier5.0 (自动搜索)*、Oligo6 (引物评价)、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 (在线服务)。

  三、模板的制备

  (1)PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

  (2)模板的取材主要依据PCR的扩增对象,可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

  (3)标本处理的基本要求是除去杂质,并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、lv仿抽提纯化,再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

  四、PCR反应条件的控制

  1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。

  2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5 mmol/L。

  3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200 umol/L。

  4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。

  5. 引物 浓度一般为0.1 ~0.5 umol/L。

  6. 反应温度

  (1)变性温度和时间95℃,30 s。

  (2)退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。

  (3)延伸温度和时间72℃,1 min/kb(10 kb内)。

  (4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)

  7. 循环次数 :一般为25 ~30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。

  五、PCR的循环参数

  1. 预变性(Initial denaturation)

  模板DNA*变性与PCR酶的*激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

  2. 循环中的变性步骤

  循环中一般95℃,30足以使各种靶DNA序列*变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不*,易造成扩增失败。

  3. 引物退火(Primer annealing)

  退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

  退火温度对PCR的特异性有较大影响。

  4. 引物延伸

  引物延伸一般在72℃进行(Taq酶适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略

  延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

  5. 循环数

  大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。

  6. 后延伸

  在后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸*,并使单链产物退火成双链。

  六、PCR步骤

  1. DNA变性

  (90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA。

  2. 退火

  (25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

  3. 延伸

  (70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性*)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。

  七、PCR检测

  PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。

  注意事项

  1. 由于PCR反应灵敏度很高,因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果,特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。

  2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪,经常检查PCR仪上的程序正确与否。

  3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。

  4. 试剂购回后应分装成小份使用,这样一旦有污染发生,可以立即丢弃污染的试剂,不会造成大的损失;试剂分装也有助于减少反复冻融次数(例如dNTPs对反复冻融敏感)。

  5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以充分混匀。

  6. 使用阴性对照检查污染的发生。

  7. 使用阳性对照(能良好扩增的样本)。

  8. 电泳时使用DNA分子量标准品(指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败)。

  9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二结构的模板时适量使用添加剂(glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度;glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用;DMSO 减少二结构的发生,并通过减弱非特异性引物结合的稳定性,提高反应的特异性)。

  10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶(避免反复冻融),每次取酶时都使用新的枪头酶,酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加,直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。

  11. PCR产物的电泳检测时间,一般为48 h以内,有些zui好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。

  收起

  其他

  一、 PCR反应的关键环节

  1. 模板核酸的制备。

  2. 引物的质量与特异性。

  3. 酶的质量。

  4. PCR循环条件。

  二、 PCR常见问题及对策

  1. 假阴性,不出现扩增条带

  (1)模板原因

  ① 模板中含有杂蛋白质。

  ② 模板中含有Taq酶抑制剂。

  ③ 模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白。

  ④ 在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。

  ⑤ 模板核酸变性不*。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。

  (2)酶失活

  ① 需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。

  ② 忘加Taq酶或溴乙锭。

  (3)引物

  ① 引物质量。

  ② 引物的浓度。

  ③ 两条引物的浓度是否对称。

  解策:

  ① 选定一个好的引物合成单位。

  ② 引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。

  ③ 引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。

  ④ 引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。

  (4)Mg2+浓度

  ① 浓度过高降低PCR扩增的特异性。

  ② 浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

  (5)反应体积的改变

  ① 通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定;

  ② 在做小体积如20 ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。

  (6)物理原因

  ① 变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,有可能出现假阴性。

  ② 退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

  ③ 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。

  (7)靶序列变异

  ① 靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合。

  ② 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。

  2. 假阳性,出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

  (1)引物设计不合适

  ① 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。

  ② 靶序列太短或引物太短。

  (2)靶序列或扩增产物的交叉污染

  ① 整个基因组或大片段的交叉污染。

  解决方案:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。

  ② 空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生。

  解决方案:可用巢式PCR方法来减轻或消除。

  3. 出现非特异性扩增:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

  (1) 引物与靶序列不*互补或引物聚合形成二聚体。

  (2) Mg2+离子浓度过高。

  (3) 退火温度过低。

  (4) PCR循环次数 过多有关。

  (5) 酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

  其对策有:必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。

  4. 出现片状拖带或涂抹带

  (1)原因

  ① 酶量过多。

  ② 酶的质量差。

  ③ dNTP浓度过高。

  ④ Mg2+浓度过高。

  ⑤ 退火温度过低。

  ⑥ 循环次数过多引起。

  (2)对策。

  ① 减少酶量。

  ② 调换另一来源的酶。

  ③ 减少dNTP的浓度。

  ④ 适当降低Mg2+浓度。

  ⑤ 增加模板量。

  ⑥ 减少循环次数。

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  标签:BUNSEN本生 试剂 抗体 DNA双链 移液枪 离心管 薄壁管 PCR缓冲液

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